Окрашивание по Граму: методика и теоретическое объяснение

Окрашивание по Граму широко распространено в микробиологии, так как это один из простейших способов дифференцировать бактерии по составу их клеточной стенки. По Граму все бактерии можно разделить на грамположительные (грамм (+)) и грамотрицательные (грамотрицательные (-)). Метод окрашивания по Граму был разработан в 1884 году и с тех пор не утратил своей популярности, хотя несколько раз подвергался модификации.

Структура клеточной стенки

Окрашивание по Граму позволяет определить, является ли конкретная бактерия грамположительной или грамотрицательной. Разделение бактерий на грамм (+) и грамм (-) осуществляется согласно строению их клеточной стенки.

В клеточной стенке содержится наибольшее количество пептидогликана (муреина) — сложного вещества, в состав которого входят пептапептид и гликан. Гликан состоит из чередующихся остатков N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, связанных вместе β-1,4-гликозидными связями. Пептидогликан обеспечивает поддержание формы клеток, осмотическую защиту и антигенные функции.

Основные различия грамположительных и грамотрицательных бактерий

Толщина пептидогликанового слоя у разных бактерий неодинакова. У бактерий, отнесенных к грамположительным, он составляет от 15 до 80 нм, а у грамотрицательных — от 2 до 8 нм. В то же время грамотрицательные бактерии имеют особую структуру под пептидогликановым слоем, которая отсутствует у грамположительных бактерий — периплазматическое пространство. Это пространство заполнено гидролитическими ферментами — -лактамазой, рибонуклеазой 1, фосфатазой. Именно эти ферменты отвечают за устойчивость грамотрицательных бактерий ко многим антибиотикам.

Пептидогликановый слой грамм (-) бактерий связан с липополисахаридом, антигенной структурой, содержащей эндотоксин. У грамотрицательных (+) бактерий теиновые кислоты выполняют аналогичные функции.

У грамотрицательных бактерий есть дополнительная структура — наружная мембрана.

Суть метода окрашивания

Перед окрашиванием готовятся мазки исследуемых бактерий. Для этого на предметное стекло капают воду и добавляют в нее культуру микроорганизмов с бактериальной петлей. Затем, после полного высыхания воды, пятно фиксируется: предметное стекло несколько раз подносят к пламени горелки. Окрашивание мазков по Граму более эффективно, чем окрашивание живых бактерий: молекулы красителя лучше связываются с мертвыми клетками.

Окрашивание проводится в несколько этапов:

1. На фиксированный мазок накладывают небольшие кусочки фильтровальной бумаги и заливают основным красителем — генцианвиолетом или метиленовым синим.
2. Через 3-5 минут снимите цветную фильтровальную бумагу и залейте мазок раствором Люголя на 1 минуту. В этом случае препарат темнеет.
3. Раствор Люголя сливают и мазок обрабатывают чистым этиловым спиртом: на препарат капают несколько капель, через 20 секунд сливают. Процедуру повторяют 2-3 раза.
4. Стакан с исследуемым препаратом промывают дистиллированной водой.
5. Проводится дополнительное окрашивание — препарат тонируют фуксином. Через 1-2 минуты краситель смывается.
6. После высыхания воды мазок исследуют под микроскопом. Грамположительные бактерии будут сине-фиолетовыми, грамотрицательные — розовыми или красными.

Причины различного характера окрашивания

Как описано выше, при окрашивании бактерий по Граму грамположительные бактерии окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, а грамотрицательные — в красный или розовый. Причина дифференциального окрашивания бактерий этим методом заключается в том, что после того, как растворимая форма генцианвиолета попадает в клетку, краситель превращается в нерастворимую форму йода. Во время обработки бактерий этиловым спиртом липиды извлекаются из мембраны под действием этого неполярного растворителя. Впоследствии мембрана становится пористой и больше не является значительным препятствием для вымывания красителя. Однако пептидогликан более устойчив к действию неполярных растворителей, в том числе спирта. Именно он препятствует смыванию красителя, поэтому бактерии с толстым слоем муреина становятся сине-фиолетовыми (грамположительными), а после обработки спиртом их цвет не меняется.

Тонкий мышиный слой грамотрицательных бактерий не может удерживать молекулы красителя в клетке, поэтому после действия спирта они обесцвечиваются — окрашиваются грамотрицательными.

После воздействия мазка из фуксина при окрашивании по Граму грамположительные бактерии остаются сине-фиолетовыми, а грамотрицательные бактерии приобретают розово-красный оттенок.

Примеры Грам(+) и Грам(-) бактерий

Грамотрицательные бактерии включают цианобактерии, серные бактерии, железобактерии, хламидии, риккетсии, уксусные бактерии, многие метилобактерии, тионовые бактерии, арсенитобактерии, карбоксибактерии.

Грамположительные бактерии — это бифидобактерии, многие водные бактерии, стрептококки и стафилококки.